作者：呂曉芬博士 伍小春（小C）
單克隆抗體的作用機制及其體外功能實驗（下）
體外單抗的生物功能實驗能準確的評估一個抗體的效應功能，它是前期抗體研發階段抗體的篩選和臨床前抗體功能的進一步驗證以及驗證生物類似藥與原研藥的效價比較的一系列重要方法。
下面介紹CDC和吞噬作用的機制和方法操作原理。
另ADCC作用的機制和方法請見《單克隆抗體的作用機制及其體外功能實驗（上）》分享。
CDC
CDC是另外一個依賴于抗體介導的細胞殺傷作用。它的作用需要經典的補體激活途徑激活補體。這是個級聯過程。當抗原抗體結合后，補體分子C1q與IgG的CH2區域結合，由于抗原抗體的復合物使C1q與IgG由低親和力轉向高親和力，進而激活涉及一系列補體蛋白的級聯過程，繼而形成膜攻擊復合物（MAC），在細胞膜上產生小孔，促進水和溶質自由進出細胞，導致細胞裂解死亡。
抗體能在體內發揮功效CDC也起一定的作用。但是CDC在體內抗腫瘤特性的作用尚不清楚，有可能更多取決于腫瘤靶標而不是抗體。這些抗腫瘤的抗體在體內發揮CDC作用取決與靶細胞表面抗原的表達量或者細胞表面某一部分的抗原密度。激活C1q需要高密度的與靶細胞表面抗原結合的抗體。腫瘤細胞表面經常高表達一些補體抑制劑如CD46，CD55和CD59，這些分子能夠保護靶細胞免受補體介導的殺傷作用。因此，以上這些因素導致許多IgG1的抗體只發揮非常弱的CDC作用。
與ADCC檢測實驗相比，CDC體外檢測相對簡單，先把靶細胞稀釋至特定密度，加至96孔板中，然后加入梯度稀釋好的抗體于37°孵育10-30min，然后加入補體于37°孵育1-24h。由于一些補體蛋白具有種屬特異性，所以我們研究人的靶點以及其對應的嵌合抗體和人源化或是全人的抗體時，我們必須用人的血清。即使在前期的快速篩選抗體階段會用到兔血清，但對于臨床有參考意義的數據還是需要人的血清。小鼠的血清在CDC實驗中殺傷靶細胞的效果很差而且鼠血清本身對靶細胞的毒性相當大。這就導致實驗結果分析時難以分辨是否是抗體介導的殺傷。因而用鼠血清做補體的CDC數據相對少。實驗中，有不同的方法測量靶細胞的裂解。最常用的是用非滲膜的熒光染料PI （propidium iodide），它能結合已裂解細胞的DNA，但是不能穿透正常細胞的細胞膜，通過流式檢測CDC作用?；蛘邫z測LDH（乳酸脫氫酶）的釋放，或者calcein AM標記靶細胞，然后測Calcein AM的釋放（以上都是通過測死細胞來檢測CDC作用），也可以通過測ATP的量來檢測活細胞數來檢測CDC作用。
通過對ATP 進行定量測定來檢測培養物中活細胞數目是一種均質快速的檢測CDC結果的方法。ATP 是活細胞新陳代謝的一個指標。均質的“加樣- 混合- 檢測”操作方案使得細胞裂解和產生的發光信號與存在的ATP 量成正比，而ATP量直接與培養物中的細胞數量成正比。結果見圖12
圖12： 通過測ATP的量檢測CDC效應
Phagocytosis assay
小鼠體內進行的大多數據表明IgG抗體在體內發揮功能很大一部分依賴于巨噬細胞以及其表面表達的FcrRs。因此準確理解吞噬作用的原理和操作方法是抗體體外活性檢測的重要部分。吞噬作用從原理上理解包括兩種一種是抗體的Fab段與靶細胞上的靶點結合，Fc 段與巨噬細胞上的FcrRs結合，進而發生ADCP作用(見圖1)；另一種是CD47抗體介導的吞噬作用，CD47是免疫球蛋白超家族成員。CD47是細胞表面一個重要的"self"標記，是調節巨噬細胞吞噬作用的一個重要信號。CD47可以與巨噬細胞表面SIRPα結合，磷酸化其ITIM，隨后招募SHP-1蛋白，產生一系列的級聯反應抑制巨噬細胞的吞噬作用。研究表明，幾乎所有的腫瘤細胞和組織都高表達CD47，是對應正常細胞和組織的3倍。通過CD47這個"self"信號，腫瘤細胞有效的躲避了巨噬細胞的吞噬作用。通過CD47抗體block這個"別吃我"的信號，使巨噬細胞發揮吞噬作用。圖13
圖13： 阻斷CD47使巨噬細胞發揮吞噬作用
吞噬作用的測定一定程度上與ADCC相似，因為他們都依賴于共孵育的兩種細胞。靶細胞與效應細胞（主要是巨噬細胞）孵育1-4小時，但有些情況需要孵育更長時間。還有巨噬細胞是貼壁細胞，所以孵育完后需要消化用流式細胞儀檢測。而巨噬細胞是由新鮮的 PBMC加入一定量的HM-CSF誘導分化4-7天得到。檢測方法主要有顯微鏡技術或流式細胞術的方法。由于顯微鏡的技術操作比較費力而且結果分析容易受到主觀影響所以一般選用流式細胞術，此方法快速和并且容易定量。流式細胞法檢測結果見圖14和圖15
圖14 吞噬作用流式圖
Q1:未發生吞噬的巨噬細胞；
Q2：發生吞噬的巨噬細胞和靶細胞（雙陽）
Q3:被標記的靶細胞；
Q4: 未被標記的靶細胞
圖15： CD47 抗體介導的吞噬作用
隨著抗體類藥物的快速發展，單抗的體外功能實驗（ADCC和CDC和吞噬作用）發揮越來越重要的作用。他們不僅可以給抗體研發早期-抗體篩選階段，抗體改造階段提供重要的指導作用和參考價值，也可檢測制品的批間一致性，從而間接反映生產過程的穩定性，可保證每批制品應用于人體的安全性和有效性。
參考文獻
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